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10x Genomics空間轉錄組測序
背景介紹
基因表達具有時間特異性和空間特異性。時間特異性通常可以通過對不同時間點的樣本取材，再使用單細胞轉錄組測序技術來進行解析。然而，空間特異性信息常常難以獲得。常規轉錄組測序和單細胞轉錄組測序無法還原細胞所處的原始位置信息，而傳統的原位雜交技術又很難實現高通量檢測。 10x Genomics Visium空間轉錄組技術，可在組織原位以超高分辨率研究基因表達特征和空間分布。此外，結合單細胞轉錄組和空間轉錄組進行聯合研究，可使空間位置的基因表達研究深入到超高分辨率的單細胞層次，對于癌癥、免疫、神經、發育等領域，有著令人期待的應用前景。
不同層面轉錄組研究
技術原理
對新鮮冷凍組織或FFPE組織進行包埋和切片，并將其放置在基因表達玻片上的捕獲區內（新鮮冷凍組織需先摸索組織切片的目標區域透化條件 , 以便確定透化最佳條件）。基因表達芯片有4個點陣區域（6.5mmx6.5mm） ，每個點陣均含有4,992個 barcoded spot（直徑為55 μm），每個spot有一個獨特條形碼序列用于位置定位。進行H&E染色后，在明場顯微鏡下觀察玻片上的組織切片，之后對組織進行透化處理，以釋放出細胞中的mRNA（新鮮冷凍組織）或連接的探針對（FFPE組織） 。這些mRNA或探針對與spot上帶有空間條形碼的寡核苷酸相結合。通過生成cDNA的逆轉錄反應（新鮮冷凍組織）或延長反應（ FFPE組織）引入空間條形碼。將帶有條形碼的分子混合后進行下游處理，制備出立即可測序的文庫。生成的10x條形碼文庫與Illumina測序儀上的標準短讀長NGS測序兼容，能夠實現整張組織切片的大規模轉錄分析。測序數據中空間條形碼序列將轉錄信息映射回組織切片中的起始位置，從而還原轉錄本在組織中的位置分布，實現基因表達的空間可視化。
Visium空間基因表達玻片的組成
注： 每張玻片包含2個或4個捕獲區，每個捕獲區含有約5,000個帶有條形碼的數據點，而每個數據點又包含數百萬條帶空間條形碼的捕獲寡核苷酸。組織mRNA在釋放后與這些寡核苷酸結合，可實現基因表達信息的捕獲。
Visium空間基因表達的流程圖
注： 對新鮮冷凍組織或FFPE組織進行切片，并將其放置在文庫制備玻片上，然后進行固定，通過H&E或免疫熒光（IF） 染色并成像，接著添加空間條形碼并構建文庫。對制備好的文庫進行測序，并對數據進行可視化。
結果展示
分群可視化結果（左）；Spots分群圖（中）；Marker基因表達熱圖（右）
亞群聚類熱圖（左）；基因Term關系網絡圖（中）；GSEA富集分析（右）
產品優勢
雙重信息
實現基因表達數據與空間定位信息的結合，解析多種類型組織切片樣本中基因表達譜；
分辨率高
每個芯片點陣包含近5,000個spot，每個spot平均分辨率為1至10個細胞，可以檢測幾千個基因；
結果無偏
無需組織解離，保留組織結構及細胞微環境，鑒定異質性組織中細胞類型；特殊UMI設計，避免反轉錄偏好性，降低誤差；
FFPE兼容
突破從FFPE（石蠟包埋）組織中獲取空間基因表達信息的障礙；
平臺完善
具有冷凍切片機、超高分辨率顯微鏡、 10x Genomics Visium等服務平臺；
團隊專業
中科院博士帶領專業實驗團隊。現已累積50余種不同組織類型、數百余個樣品的空間轉錄組實驗經驗。
送樣要求
與單細胞聯合分析
單細胞轉錄組測序能很好的揭示了組織異質性，但由于獲取細胞懸液時對組織進行了酶解，從而導致組織空間位置信息丟失。而空間轉錄組測序技術可以同時提供空間位置信息和基因表達信息，但檢測的單位不是單細胞水平，綜合運用單細胞檢測技術和空間轉錄組檢測技術將兩種檢測結果進行聯合分析，對空間轉錄組的檢測結果進行精確的細胞類型注釋，從而在不同應用場景中更加精準的揭示細胞相互作用和組織理解。
空間轉錄組和單細胞轉錄組整合研究應用場景
應用方向
腫瘤研究： 腫瘤微環境、腫瘤異質性；
免疫研究： 免疫微環境；
發育生物學： 細胞類型的空間分布、時空變化；
腦神經學： 神經系統研究、腦圖譜構建；
病理學： 病例切片的空間基因表達信息；
細胞圖譜： 構建三維空間圖譜。
應用案例
單細胞分辨率下人類腸道發育的時空分析
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
發表雜志： Cell（IF: 41.582）； 發表時間： 2021年 2月； 應用技術： 10x Genomics單細胞轉錄組測序， 10x Genomics空間轉錄組測序
本研究將單細胞轉錄組測序和空間轉錄組測序進行聯合，繪制了隨時間變化的腸道形態發生。確定了101個細胞狀態，包括上皮細胞和間充質祖細胞群以及與關鍵形態發生相關的重要階段過程。描述了隱窩-絨毛軸形成的原理，神經、血管、間充質形態發生和腸道的免疫種群，鑒定了發育中的成纖維細胞和肌纖維細胞亞型的分化層次，并闡述了它們的不同功能。明確了佩爾斑和腸道相關淋巴組織的起源，并描述了位置特異性免疫程序。本研究使用這一資源來呈現了形態發生梯度的無偏分析，這一梯度能夠指導細胞分化的連續波并定義與罕見發育性腸道疾病相關的細胞和位置，匯編了一個公開可用的在線資源，即胎兒腸道發育的時空分析資源（STAR-FINDer），以期促進后續的相關研究工作。
腸發育圖譜研究技術路線
空間轉錄組和單細胞轉錄組測序整合對腸道發育的時空分析
